星形胶质细胞是脑内数目最多的细胞类型，其细胞组成的异质性与功能多样化的关系尚不明确。本文作者采用区域间荧光激活分选技术（intersectionalfluorescence-activatedcellsorting–basedstrategy）,鉴定了脑内5种不同的星形胶质细胞亚群，并进一步分析其功能及与胶质细胞瘤内细胞亚型进行了比较。
首先，作者采用携带有星形胶质细胞广谱标记物—醛脱氢酶1家族成员L1(aldehydedehydrogenase1familymemberL1,Aldh1L1)报告基因小鼠（Aldh1l1–GFP），及星形胶质细胞的其他细胞表面标记物，如：CD51,CD63及CD71，对鼠脑嗅球（olfactorybulb,OB）、皮层、脑干、丘脑、小脑分离的星形胶质细胞进行分析，发现5种具有不同标记及分子特征的星形胶质细胞群，分别命名为A、B、C、D、E群。免疫标记显示CD51（+），Aldh1l1–GFP（+）的B、C群星形胶质细胞主要位于皮质内层，而CD51（-）的A、D、E星形胶质细胞位于皮质外侧（图1）。
图1.Aldh1l1-GFP星形胶质细胞亚群的分离a：星形胶质细胞分选示意图；抗CD51，抗CD63和抗CD71组合区分成人大脑中星形胶质细胞亚群：皮层（b）、脑干（c）、丘脑（d）、OB（e）、小脑（f）和脊髓（g）；h:星形胶质细胞群免疫表达谱。脑皮质外层（i,j）和内层（k,l）的Aldh1l1-GFP表达和CD51表达的免疫荧光；m:维恩图描绘了星形胶质细胞群中表达的基因及相互关系；n:每个星形胶质细胞群的基因热图。
作者进一步分析各星形胶质细胞亚群的胚胎发育起源及特性，发现星形胶质细胞A,C和E群在鼠出生后早期即出现，而B、D群出现在皮层发育晚期。体外培养发现，C群增殖速度快，而A群细胞迁移能力强（图2）。
图2.a-d：各星形胶质细胞种群在胚胎发育不同时间P2（a），P7（b），P14（c）和P28（d）的含量变化。e:各亚群的标记物；星形胶质细胞群A（f，h）和C（g，i）的培养中BrdU染色（f，g）及Transwell测定（h，i）；j：BrdU的定量k：Transwell定量；DAPI用于染色细胞核。
由于星形胶质细胞对突触形成及功能发挥重要的作用，因此作者对各星形胶质细胞群的表达基因进行富集分析，C群细胞富含突触形成及功能相关基因，同时C群细胞高表达谷氨酰胺转运、离子转运及突触富集等相关基因。在体外与神经元的共培养中，星形胶质细胞C群也显示了明显的促突触生长及促进突触后电活动的特性（图3）。
图3.星形胶质细胞亚群对突触产生作用不同。GSEA图，a:C群（PopC）基因与突触形成和功能相关的基因进行比较。b：基因表达热图分析C群细胞与其他细胞群差异。‘neg’代表Aldh1l1–GFP-阴性的对照细胞；c–i：突触标记物PSD95与突触蛋白（c-e）或者MAP2与突触蛋白（f-h）共表达的代表性图像。体外星形胶质细胞（c，f，i）共同培养后的定量（i）A细胞（d，g，i）或群体C细胞（e，h，i）。j-k：膜片钳技术记录神经元自发性兴奋性或抑制性突触后电流（spontaneousexcitatoryandinhibitorypostsynapticcurrents，sEPSCsandsIPSCs,respectively)。
星形胶质细胞瘤是脑内最常见的神经上皮肿瘤，作者进一步比较了各星形胶质细胞群与人胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）分子亚型的基因。发现星形胶质细胞A–D亚群与GBM经典型，A–C与GBM神经元型，B亚型与GBM间充质型密切相关。但没有一种细胞群与胶质瘤CpG岛甲基化型(GCIMP)或前神经元型相关。同时在Ras突变及CRISPR剪切抑癌基因产生的鼠胶质瘤中，同样发现了与星形胶质细胞各群对应的肿瘤细胞群（图4）。
图4.a：星形胶质细胞群（柱：每个区域内的基因首先居中）和人胶质母细胞瘤（行：来自癌症基因组图谱（TCGA），n=例）的mRNA谱Pearson相关性（亮红色或蓝色分别表示?7,个基因的r值0.1或-0.1）在相应的对照组）。负号表示Aldh1l1-GFP阴性对照群体。b-d：来自恶性胶质瘤的Ras模型P14的代表性图像（e-g）来自恶性胶质瘤CRISPR模型P70的的代表性图像。b，e中的图像来自全脑;虚线代表皮质中线。b和e中的虚线分别是c和f中截面的平面。h-j：通过组合使用CD51和CD71细胞表面标志物，显示肿瘤细胞分布饼图及比率。
接着在分析鼠CRISPR胶质瘤进展过程中不同时间脑电活动时，作者发现肿瘤P40时开始明显的脑电异常活动，P70时发展为自发性癫痫，并验证了星形胶质细胞B-D群在P30时数量逐渐增加，与脑电活动密切相关（图5）。
图5：a.CRSPR模型中肿瘤进展的时间过程示意图。b-d:来自P30（b），P50（c）和P70（d））的含有肿瘤的小鼠的代表性EEG记录;注意肿瘤进展期间进行性皮质过度兴奋。e-g:在P30-P70进展期间，肿瘤细胞可细分为具有代表性的群体A-D（及另外的）。h:肿瘤进展期间每个发作峰值活动的定量分析。I：胶质瘤亚群构成的定量分析。
作者进一步证实脑电活动与胶质瘤细胞C,D亚群数量及异常的突触产生相关（图6）。胶质瘤细胞群B及D迁移速度明显快于细胞群C。因此作者认为胶质瘤中不同亚群在肿瘤进展中发挥不同的作用。
图6.胶质瘤细胞亚群功能多样性。a：GSEA图比较胶质瘤细胞群C的分子特征与癫痫相关基因。b，c：肿瘤（T）和对照组（C）中PSD95表达。d-g：P70时脑中PSD95染色（红色）的代表性低倍（d）和高倍（e-g）图像。h：FACS和Transwell试验的示意图。i-m:显示细胞的代表性图像。已经通过Transwell迁移的胶质瘤细胞（i）或FACS分离的胶质瘤群体B（j），C（k），D（1）及细胞总量。
通过上述实验，作者认为成人脑内的不同星形胶质细胞群与胶质瘤内的亚群具有细胞、分子及功能特性的相关性。星形胶质细胞群及星形胶质细胞瘤群分别在正常脑发育、突触形成或肿瘤进展、癫痫发生等生理、病理过程中发挥不同的作用。该研究对今后开展不同星形细胞群在神经系统疾病中的作用具有重要意义。
本文由复旦大学上海医学院病理系刘颖教授摘译，未经允许，请勿转载。
本期编辑：杜尊国
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