本文摘自人民卫生出版社出版的《脑胶质瘤基础与临床研究》，作者刘福生、金贵善；《神外前沿》发布此文，已获出版社书面授权及作者本人许可。上图来源于网络。
第四节溶瘤病毒治疗脑胶质瘤研究现状及进展（上）
溶瘤病毒治疗肿瘤是一种非常有发展前景的生物学治疗手段.但从已完成的临床试验中不难看出.其安全性和疗效仍亟待提高和改善.前期的治疗策略多是以改造病毒减低病毒毒性、引入自杀基因ˉ前药系统等展开.虽然溶瘤病毒的安全性得到保障.但疗效却十分有限.患者的生存期并未得到明显延长.病毒感效率差、在组织中分布低下以及宿主抗病毒免疫防御反应等都成为导致病毒治疗效果不佳的原因。
目前的应对策略主要围绕以下几点展开:改良病毒输注和运送方法.靶向肿瘤干细胞.重新设计和改造溶瘤病毒使其更富有活力.提高溶瘤病毒靶向特异性等.此外.联合疗法.如溶瘤病毒治疗结合免疫疗法.或联合放疗、化疗等都有望改善宿主的抗肿瘤免疫反应.巩固和增强综合疗效.
1进一步改造病毒.提升病毒毒力和肿瘤特异性
关于这一点.目前的临床前研究还是着重于通过保留病毒毒力及复制能力.提高肿瘤特异性来实现.如溶瘤性单纯疱疹病毒.策略之一是保留具有毒力的γ片段并插入肿瘤特异性启动子控制其表达.使HSV溶瘤病毒在不减弱其复制能力基础上提高其在肿瘤细胞中特异表达能力.从而提高杀伤肿瘤细胞能力.Nestin.是一种中间丝蛋白.又称巢蛋白.仅在胚胎发育早期的神经上皮中表达.出生后表达就停止.可能在神经元的分化过程中起作用.由于Nestin仅在中枢神经系统中特异表达于神经前体细胞.为神经干细胞的特征性标志物.Yoo()等在γ片段前插入Nestin启动子.使γ编码的病毒蛋白不能在成熟的神经上皮细胞中表达.但在癌变的胶质瘤细胞和脑肿瘤干细胞中却可表达.使其具备了特异靶向并杀伤中枢神经系统肿瘤细胞的能力.有研究表明.经此改造过的溶瘤病毒对Nesˉtin高表达的脑胶质瘤肿瘤细胞具有较为明显的溶瘤作用.而对原低表达的肿瘤细胞效果则不明显.
2改良病毒输注和运送方法1)增强对流输送增强对流输送(convectionenhanceddelivery.CED)是一种治疗脑胶质瘤的新的局部给药方法.是指利用影像学技术.在立体定位条件下将一根或多根微导管.直接植入瘤内或瘤腔周围脑组织.体外连接输液泵持续正压微量灌注.导管末端输注点与周围组织形成压力梯度.促使对流产生.由此克服组织间液内的阻力.使药物在病变部位均匀扩散和分布.
传统给药方式由于血脑屏障的存在.药物进入颅内抵达瘤内或瘤周的浓度较低.疗效较差.一些局部给药方式如直接注射等虽然绕过了血脑屏障.但由于药物的扩散依赖于药物在组织间液中的浓度梯度.渗透力有限.仅在注射部位附近的组织中扩散.且药物分布不均匀.CED克服了以上缺陷.不仅绕过了血脑屏障.而且其药物的分布依靠的是压力梯度.持续的压力促使药物不断向周围组织弥散.药物的分布范围更广.分子量越大的药物越不易被毛细血管吸收.能够更好地在组织间隙分布.增加局部药物浓度.作用时间更为长久.最初.溶瘤病毒是以瘤内或瘤腔内注入的方式应用于抗肿瘤治疗性实验或临床试验.为了改善疗效.又尝试了静脉内注射病毒的方式.但是为了达到疗效.需不断增加病毒剂量.虽然多数研究中并未达到病毒的最大耐受剂量.但随着病毒剂量的增加.毒副作用风险逐步加大.而CED给药方式较其他方式相比可有效降低药物的使用浓度.减轻对机体的全身性毒性反应.
能够采用CED方式进行输送的理想药物应具备如下特征:对肿瘤细胞具有特异性的毒性.对正常脑组织的毒性有限.半衰期长.不易透过血脑屏障从而对机体的全身性毒性反应弱等.CED首先于年.由Bobo()等最先提出.源于许多大分子药物难以逾越血脑屏障到达颅内.早期的CED临床试验在复发的脑恶性胶质瘤患者中进行.Laske()等在年应用该技术将TfˉCRM(运铁蛋白与一种白喉毒素无毒突变体CRM的共轭物)灌注于患者瘤内.近60%患者的肿瘤体积至少减少50%(MRI观察).虽有局部的不良反应发生.但未出现全身性毒性反应.此研究证实了CED有效运送大分子物质的能力.且可在局部区域构成高浓度环境.发生全身性毒性反应风险较小.此后.基于CED临床前研究成果的临床试验逐渐展开.美国国立卫生研究院批准了多项药物的临床I/II和III期试验.包括Topotecan、Carboplatin、IL13ˉPE38QQR和溶瘤性腺病毒细胞毒性脊髓灰质炎病毒(PVSˉRIˉPO)等.这些药物用传统方式如静脉内或腹腔内给药或瘤内注射等疗效不佳、效果有限.但采用CED方式给药时均呈现较好疗效.PVSˉRIPO是目前唯一应用于经CED方式给药.进入临床试验的溶瘤病毒.PVSˉRIPO能够选择性感黏附分子nectinˉlikemolecule5高表达的细胞.通过干扰细胞RNA转录达到溶瘤目的.恶性胶质瘤由于过表达该分子.成为PVSˉRIPO的理想靶标.针对复发性胶质母细胞瘤的I期临床试验结果令人鼓舞.显示出较好的安全性和疗效.此外.条件复制型腺病毒Deltaˉ24ˉRGD借助于CED的给药方式.在临床前研究中显示较之传统方式疗效更为显著.但尚未开展临床试验.
2)利用干细胞作为病毒载体宿主的抗病毒免疫反应是病毒治疗面临的一大障碍.利用一种“特洛伊木马”(Trojanhorse).使其能够携带溶瘤病毒入体内又不被宿主免疫细胞所识别.成为研究焦点.细胞载体纳入研究者视野.神经干细胞、骨髓来源的间充质干细胞和胚胎干细胞是目前最常采用细胞载体.体外用病毒感细胞.体内注入后即可携带病毒到达肿瘤部位释放出病毒.且不被免疫系统所识别.利用具有肿瘤趋向性的细胞作为分子或生物治疗的载体目前已成为肿瘤治疗中重要策略之一.
神经干细胞对脑肿瘤组织具有趋向性.利用该特性.使其作为载体携带治疗性基因或其他颗粒如质粒、病毒等.可应用于侵袭性生长的脑胶质瘤的治疗.我们研究小组曾证实.自杀基因CD工程化的神经干细胞可有效杀伤肿瘤细胞并延长荷瘤鼠的生存期.其他研究也显示.携带细胞因子白介素ˉ12(ILˉ12)或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisˉinducingligand.TRAIL)的基因工程化神经干细胞可明显抑制肿瘤的生长.但由于人类神经干细胞难以获得.故大多数实验转而应用人类间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells.hMSC).
hMSC较易从患者身上获得.Nakamizo()等从健康自愿者的骨髓中分离提取出hMSCs.将其应用于人胶质瘤颅内荷瘤鼠的治疗.研究中发现.无论是将hMSCs从颅内肿瘤的同侧或对侧的颈动脉内注入.hMSCs都会向颅内肿瘤区域聚集.即使将hMSCs直接接种到颅内肿瘤对侧的大脑半球.该趋化作用依然存在.进一步的研究表明.该趋化作用与胶质瘤组织中的血小板源性生长因子(plateletˉdeˉrivedgrowthfactor.PDGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor.EGF)以及基质细胞衍生因子ˉ1α(stromalcellˉderivedfactorˉ1α.SDFˉ1α)等密切相关.而与碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor.bFGF)或血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor.VEGF)无关.利用hMSC向胶质瘤的趋向性.将其应用于腺病毒的运载有望提高腺病毒在颅内肿瘤组织中的分布.Sonabend()等用条件复制型溶瘤性腺病毒感hMSCs.体外实验中观察到携带腺病毒的hMSCs在向胶质瘤细胞迁移后可释放腺病毒.释放出的腺病毒继而感胶质瘤细胞并在其中进行复制.最后溶解肿瘤细胞.体内实验也表明.将携带腺病毒的hMSC接种于颅内肿瘤的远端.借助于hMSCs对胶质瘤肿瘤细胞或组织的趋向性.腺病毒在胶质瘤中的分布明显提高.与对照组相比病毒拷贝数提高46倍之多.胚胎干细胞是另一种可考虑用做病毒载体的干细胞.胚胎干细胞作为基因载体应用于肿瘤治疗的研究目前已有诸多报道.并显示出较好的疗效.是否能运用于作为病毒载体还有待进一步考证.
3改善肿瘤微环境肿瘤实体内不仅仅是肿瘤细胞.还包括成纤维细胞、内皮细胞等正常细胞.这些细胞与细胞外基质共同构成并支撑了肿瘤生长的微环境.另外.肿瘤组织内的一些炎症细胞如肿瘤相关巨噬细胞等也具有促进肿瘤生长的作用.上述正常细胞在肿瘤组织内构成了一道屏障阻碍病毒的感.具有抵抗溶瘤病毒的抗肿瘤作用.纤维细胞外基质(fibrousextracellularmatris.ECM)是一道病毒扩散的物理屏障.有研究表明细胞外基质蛋白沉积可抑制黏液瘤病毒在肿瘤、腺病毒在乳腺转移癌中的扩散.不仅肿瘤组织内的正常细胞可构成对溶瘤病毒的防御.由于肿瘤异质性.一些肿瘤细胞亚群模拟正常细胞表型可完全或部分抵抗溶瘤病毒的感.
Yoo()等通过在溶瘤病毒基因组中引入抗血管生成基因.从而改善肿瘤微环境来实现溶瘤病毒抗肿瘤效能的增强.Vstat是脑血管生成抑制因子1的细胞外片段.具有抗血管生成作用.有研究显示其在恶性胶质瘤、肺癌及胃癌中的表达下降.实验表明Vatat体外可抑制内皮细胞的增殖.体内抑制血管的生成.在溶瘤病毒HSVˉ1中插入Vstat片段可增强其抗肿瘤效应.其机理可能在于:溶瘤病毒HSVˉ1在应用于肿瘤治疗时.可下调肿瘤细胞外基质中TSPˉ1蛋白的表达.并使IntegrinˉactivaˉtingCCN1蛋白表达增加.导致经溶瘤病毒治疗后的残余肿瘤组织中血管生成增加.在溶瘤病毒中引入Vatat.有可能通过降低由溶瘤病毒导致的血管通透性的增加.延长溶瘤病毒在肿瘤组织中的播散和抗肿瘤功效.Yoo()等通过在溶瘤病毒HSVˉ1中的γ片段前插入Nestin启动子.并插入外源基因Vatat片段.实现了对Nestin高表达胶质瘤细胞体内外抗肿瘤效应的增强.
此外.在病毒基因组表达血小板因子4(plateletfactor4.PF4).一种抗血管生成因子.可增强G47Δ杀伤内皮细胞能力.表达显性位点失活突变的FGF受体的G47Δ可阻断FGF信号通路活性.使病毒对内皮细胞和胶质瘤细胞的杀伤能力明显提高并可抑制ERK磷酸化.上述两种重组病毒.体内均可抑制U87胶质瘤肿瘤生长和瘤内血管生成.血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)等武装的溶瘤性HSV或腺病毒都有抑制肿瘤内内皮细胞及血管生成作用.在破坏肿瘤微环境、增强病毒扩散中发挥作用.
肿瘤细胞间的细胞外基质(extracellularmatrix.ECM)构成了病毒在肿瘤内扩散的物理屏障.硫酸软骨素酶(chondroitinaseABC.ChaseˉABC)可破坏这一屏障.利用表达ChaseˉABC的oHSV治疗胶质瘤.病毒在肿瘤中的扩散增强.抗肿瘤效果明显提高.
主要作者简介：刘福生，教授，主任医师，研究员，博士研究生导师。首都医科医院神经外科、北京市神经外科研究所脑肿瘤研究中心，北京市卫生技术高层次人才——神经外科学科带头人。
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