《自然遗传学》：阿尔茨海默病患者大脑的单核染色质开放性与转录组特征发布丨科学大发现原创奇点糕奇点网收录于话题#阿尔茨海默病相关,66个
无论是健康还是疾病状态，大脑各种生理过程的基因调控都是高度复杂和动态的。倘若我们将视野拉近放大到单细胞，会看到什么呢？
近日，由加州大学Irvine分校VivekSwarup领衔的研究团队，对晚期阿尔茨海默病（AD）病人的大脑进行了单核多组学分析（multi-omicsingle-nucleusstudy）[1]。
他们发现大脑细胞展现出惊人的高度异质性，还在特定细胞类型中找到了与AD有关的顺式调控因子（CREs）、转录因子及靶基因，为系统性理解和治疗AD提供了重要信息。相关研究成果发表在著名期刊《自然遗传学》上。
近年来，已有研究者对正常大脑中神经元及其他非神经元细胞，进行了分子层面的鉴定和表征。然而，在疾病状态下大脑中各类细胞的情况仍然鲜为人知，也让人们难以确定真正影响疾病的生物过程。
我们已经知道，在AD中存在大量的神经元丧失并伴随胶质化，但我们并不清楚在整个病理过程中，每种类型的脑细胞分别发挥了什么作用。
脑组织的功能基因组学数据，包括大样本RNA测序和利用转座酶研究染色质开放性的高通量测序（ATAC-seq），已经被很多GWAS研究采用[2]。但此类数据忽略了细胞个体甚至群体之间的异质性，也就使得研究结果精度十分有限。
为避免这个问题，也有科学家尝试对小鼠和人体组织进行了单细胞和单细胞核RNA测序，并发现了不同类型细胞所特有的基因转录变化[3–5]，但这些研究没有涉及相关的调控因子。
为了从表观修饰和基因转录两个层面探究与AD相关的基因调控程序，VivekSwarup带领研究团队从健康和AD死者的大脑前额叶皮质提取组织，一共分离出个单细胞核，进行单细胞核染色质易开放区域测序（snATAC-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq）。
实验流程及数据分析流程
为确保研究的严谨性，表观基因组和转录组的实验数据均已进行批次校正，然后用UMAP法[6]降维并进行Leide聚类分析[7]。
VivekSwarup团队发现：snATAC-seq和snRNA-seq数据中均存在差异显著的基因类群。
通过人工比对各类细胞中已明确的标记基因，这些类群可分别对应为以下几种主要细胞类型的特征性基因表达模式：兴奋性神经元（EX），抑制性神经元（INH），星形胶质细胞（ASC），小胶质细胞（MG），少突胶质细胞（ODC），以及少突胶质细胞祖细胞（OPC）。
表观基因组（左）与转录组（右）数据揭示的主要细胞类型。
在VivekSwarup和他的同事看来，这种划分仍然相当粗略，很明显，每个细胞类型下有大量细胞个体，也就可能存在实际上差异并不小的子群体。
例如，他们只选取少突胶质细胞及其祖细胞的sn-RNA-seq和snATAC-seq数据，进行谱系聚类分析，结果发现这些细胞实际上处于不同分化阶段，每个阶段具有不同的基因表达模式。
少突胶质细胞中存在表观基因组和转录组均有差异的细胞亚群。
在晚期AD中，每种类型的脑组织细胞究竟发生了什么变化呢？
VivekSwarup团队将重点转向了基因的顺式调控因子（cCREs）。
他们分别在晚期AD和对照组样本中构建出每种细胞类型所特有的cisco-accessibility网络[9](CCANs)，从中鉴别出cCREs及潜在目标基因。这些gene-linkedcCREs(gl-cCREs)再通过非负矩阵分解（NMF）等处理步骤，划分为多个生物功能模块。结果发现，部分功能模块在AD中的异常变化的确广泛存在于多种细胞，但在每种细胞类型下，还相应存在可以特异性区分AD和对照组的基因调控模块。
与健康对照相比，晚期AD中每种细胞类型下发生了异常基因调控的生物功能模块
同样，细胞中的转录因子（TF），是不是也与晚期AD有关呢？
VivekSwarup团队在每种细胞下进一步区分AD和健康对照，借助相关数据库分别建立转录因子调控网络。结果发现，对比健康对照，在晚期AD组织中，不同类型的细胞中发生变化的转录因子十分不同。
例如，在小胶质细胞中发生变化的转录因子是ELF5,ETS1,ETV5,SPIC和SPI1，在少突胶质细胞中则是SOX9,SOX13,SREBF1,SREBF2,OLIG1和NRF1。这些因子及它们调控的基因网络，将是AD病理中急需深入研究的新方向。
小胶质细胞（左）和少突胶质细胞（右）中的转录因子调控网络
研究进行到这里，更深层的问题出现了：是哪些基因导致了AD中胶质细胞的异质性？
为了回答这个问题，VivekSwarup团队对少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的snATAC-seq和snRNA-seq数据整合后，进行了拟时细胞轨迹分析。
这个分析的思路是：一个细胞的基因表达数据即代表这个细胞的状态，当我们把全部数据放在一起看，大量个体细胞状态就会形成一个连续谱，也就是潜在的细胞状态变化轨迹。如果把这个状态变化轨迹视为AD发展的时间线，多组学数据就可以展示出不同因素随“时间”产生的动态变化，例如基因表达、染色质开放性和TF调控模块。
研究团队使用了RVAE[10]这种编码-解码神经网络框架，从而可以生成2D的隐数据特征并可视化。
要鉴定出有意义的特异性表达基因（t-DEGs），首先需要确保生成的细胞轨迹符合实际。研究者们确认的证据为：
少突胶质细胞：成熟细胞的基因表达模式在轨迹末端增加，新细胞的基因表达模式随整个轨迹下降。
小胶质细胞：疾病相关小胶质细胞（DAM）的非TREM2依赖性表达模式增加，TREM2依赖性表达模式下降。
星形胶质细胞：细胞随轨迹线由低GFAP状态转向高GFAP状态，和疾病相关星形胶质细胞（DAA）特征性表达模式。
随后便可以找出在AD发展到晚期时，各类细胞中发生了异常变化的转录因子：
少突胶质细胞：核呼吸因子1（NRF1）和固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）。有研究认为Aβ会抑制SREBF-1激活[11]。
小胶质细胞：两个ETS家族——SPI1和ETSvariant5(ETV5)。两者都在晚期AD中明显上调。
星形胶质细胞：CCCTC-结合因子(CTCF)和FOSL2。在晚期AD中下调的CTCF被认为是一种十分重要的染色质调控因子[12]。
少突胶质细胞（左）、小胶质细胞（中）和星形胶质细胞（右）的拟时细胞轨迹。
可以说，这项研究具有十分重要的价值和意义。
一方面，该研究揭示出AD晚期密切相关的顺式调控因子、转录因子、高遗风险位点，为后续AD病理研究提供了更多方向，也有希望从中发现新的治疗靶点。
另一方面，该研究构建了多组学分析完整流程的优秀蓝图。
参考文献：
[1]MorabitoS,MiyoshiE,MichaelN,etal.Single-nucleuschromatinaccessibilityandtranscriptomiccharacterizationofAlzheimersdisease[publishedonlineaheadofprint,Jul8].NatGenet.;10./s---z.doi:10./s---z
[2]NottA,HoltmanIR,CoufalNG,etal.Braincelltype-specificenhancer-promoterinteractomemapsanddisease-riskassociation.Science.;():-.doi:10./science.aay
[3]MathysH,Davila-VelderrainJ,PengZ,etal.Single-celltranscriptomicanalysisofAlzheimersdisease[publishedcorrectionappearsinNature.Jun17;:].Nature.;():-.doi:10./s---2
[4]ZhouY,SongWM,AndheyPS,etal.Humanandmousesingle-nucleustranscriptomicsrevealTREM2-dependentandTREM2-independentcellularresponsesinAlzheimersdisease[publishedcorrectionappearsinNatMed.Jun;26(6):].NatMed.;26(1):-.doi:10./s---9
[5]GrubmanA,ChewG,OuyangJF,etal.Asingle-cellatlasofentorhinalcortexfromindividualswithAlzheimersdiseaserevealscell-type-specificgeneexpressionregulation.NatNeurosci.;22(12):-.doi:10./s---4
[6]McInnes,L.,Healy,J.,Saul,N.Groberger,L.UMAP:UniformManifold
ApproximationandProjection.J.OpenSourceSoftw.3,().
[7]TraagVA,WaltmanL,vanEckNJ.FromLouvaintoLeiden:guaranteeingwell-connected
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